【感染科普笔记2023-6-21】宗志勇丨基因组测序用于耐药菌调查：优势与瓶颈
本帖最后由 wuxing718 于 2024-9-27 17:42 编辑宗志勇丨基因组测序用于耐药菌调查：优势与瓶颈https://mp.weixin.qq.com/s/cu3YpNUM4z03jx6xRD8tgA
讲者丨宗志勇（四川大学华西医院）
整理丨丁健/宋芳琳（青岛市黄岛区中心医院）
审核丨孔晓明（溧阳市人民医院）
来源丨SIFIC 2022“全国感控与耐药感染”联合大会
基因组测序目前在临床感染性疾病的诊断中应用越来越广泛，但是在我国的医院感染防控中应用还比较少，值得大家关注。基因组测序的应用包括确定病原体种类，进行病原体同源性分析。通过同源性分析，可以发现和确认传染源，追踪耐药菌如耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌（CRKP）在不同医院之间（区域内）的传播以及医院内部之间的传播，便于早期采取行动或者采取联合行动。宗志勇教授通过具体案例讲述了基因组测序技术应用于耐药菌调查的优势与瓶颈及实际应用价值。
一、基因组测序的优势
[*]确认是否为医院感染暴发。确认医院感染暴发有很多手段，比如肠杆菌基因组内重复序列聚合酶链反应（ERIC-PCR），速度非常快，但是分辨率不够高；脉冲场凝胶电泳（PFGE）的分辨率要高于ERIC-PCR，但是耗时长（1周），操作繁琐，而且它的分辨率低于基因组测序。举例：4名患者的临床标本里面分离到碳青霉烯耐药的沙雷菌，这4株沙雷菌是不是同源呢？是否需要启动调查呢？方法1：ERIC-PCR检测，从条带谱来看，1号、2号、4号之间有同源性，而3号和其他3个不同源。方法2：对这4名患者的菌株进行测序，发现4个菌株均属一个克隆，同源性非常近，可以确认为医院感染暴发事件。
[*]确定医院感染暴发来源美国一起类鼻疽伯克霍尔德菌多地暴发的案例，4个病人都感染了类鼻疽。类鼻疽伯克霍尔德菌在美国很少见。经过基因组测序，发现这4株菌同源。通过基因库比对后发现这4株菌跟印度的伯克霍尔德菌的基因组非常接近，应该属于同一个克隆。通过基因库，发现这些患者都使用了一种来自印度的芳香剂，猜测该芳香剂在印度生产的过程中，被当地的土壤或者水污染，导致类鼻疽输入。通过基因测序技术，不但明确了医院感染暴发事件，而且锁定了传染源。
美国麻省医院的一个团队，发现了ECMO患者的暴发涉及到几个跟水有关系的病原体，包括罗尔斯菌、铜绿假单胞菌和伯克霍尔德菌。通过分析，进一步调查ECMO的水管路，区别于其他检测方法，基因组技术明确了它们之间的同源性。
从以上的应用可以看出基因组测序有自己的优势：
[*]第一，它比常规的PFGE和ERIC-PCR能够提供更高的分辨率，往往是金标准。
[*]第二，基因组测序是发展趋势。因为它能把不同地方、不同医院、不同菌种之间的基因组数字化后上传到基因库里面，任何人都可以利用它来进行分析。PFGE不同实验室之间结果可能存在较大差异，基因组屏蔽了这种差异，不同医疗机构间重复性更好。
[*]第三，基因组测序联合院感的常见措施，比如环境采样、主动筛查、病例调查，可以分离到细菌，最大化的指导多重耐药菌的防控，调查细菌感染所致的医院感染暴发，具有很强的优势，还能够把数据保存起来跟世界其他地方的基因进行对比分析，可发现之前没有引起重视和关注的环节。比如调查某一起医院感染暴发，通过和基因库比对，发现别的地方也出现同样的问题，可说明它在生产厂家就被污染，排除医院的问题，也有助于区分责任。基因组测序在临床应用较多的是宏基因组测序，但目前基因测序的研究还不够深入，需要一些分析的工具。希望宏基因组测序能深化，一方面提供感染疾病的诊断；另一方面还可以提供病原菌的遗传信息，从而分析院感的传播，甚至可以分析患者的遗传背景。
二、基因组测序的瓶颈（一）技术瓶颈
[*]阈值瓶颈。基因组测序的cut off值即阈值是可操控性的，比如CRKP全世界比较喜欢用≤21个SNP基于单核苷酸多态性 (Single-Nucleotide Polymorphism, SNP)来划定同一个克隆，但其实这个cut off值主要是在欧洲调查医疗机构之间传播应用的，它不太适合用于医院内部调查。选用不同的SNP作为标准，结果会有很大的差异。目前为止，即使对肺炎克雷伯菌也缺乏公认的cut off值，而且现在很多研究也发现，对不同的序列型 (Sequence type, ST)类型，有不同的cut off值，不同的进化速度，应该有不同的阈值，不应该用一个普遍的阈值。
[*]速度瓶颈。传统的基因测序主要还是基于纯培养，而培养出菌需要两三天的时间，再做基因组测序，还需几天时间，时间比较慢，不太适合紧急调查。随着宏基因组测序的发展，由于其不基于纯培养，可直接用血液和痰液等标本进行测序，将在速度上得到很大提升。
（二）实践瓶颈
[*]思想瓶颈。很多人觉得基因组测序太难，比较高大上，实际这项技术全世界已经开展很多年，要克服畏难心理，主动拥抱它。
[*]费用瓶颈。不同的地方收费标准不一样，一个菌大约在200到400元之间，可以跟大医院联合，降低成本。
[*]分析瓶颈。如果只交给公司分析，耗时较长，想要及时得到结果，最好自己进行分析。分析工作需要两三天的培训，如果只是做简单的同源性分析，只需要有一台能装Linux系统的电脑，不需要特别高的配置。
[*]价值瓶颈。国外有文献报道，澳大利亚布里斯班的3家医院2017-2021年期间的2000多株菌，全部做基因组测序，耗费大量资金，发现有三分之一都形成了cluster，都是同一个克隆，同时还发现了33个cluster有医院之间的传播。英联邦的体系转病人很频繁，很容易发生医院之间传播，研究做的很好，却没有体现很好的价值，没有转化成感控的实践。另一篇发表在美国微生物会刊m Systems的文章提到，匹兹堡大学2016-2018年的2000多患者的3000多菌株做了全基因组测序，发现很多新菌种，还发现很多医院内的传播。虽然做了这么多研究，却没有采取实际行动，没有挖掘出实际价值。
（三）基因组测序的实际价值
[*]追踪区域性传播源头。2016年瑞士苏黎世大学从两个心脏手术后感染奇美拉分枝杆菌的病人开始启动调查，发现了一起影响全世界的大规模的医院感染暴发事件。这个菌很少见，平均潜伏期较长（一年半），死亡率极高，治疗成功的案例很少，怎么会突然出现2例呢？用基因组测序做了同种同源分析，发现是同一个克隆，随后追踪了6个病人，溯源到冷热水箱，最终发现，冷热水箱是源头。因为全世界绝大多数国家包括中国的多家医院都使用同一品牌同一型号的水箱，在世界上造成了很大影响。
[*] 调查源头，采取行动。宗志勇教授团队曾对医院ICU出现ST16型CRKP事件进行了调查。查阅文献猜测可能跟水有关系，此前已明确CRKP是在ICU里面获得的，于是进行了针对ICU水源的采样和一系列的基因组分析，最终发现ST16型CRKP来自一个水槽。不同房间里的水槽共用一个下水道，病原菌可以从一个水槽传到另外一个水槽。通过以上调查，证明洗手池是患者感染CRKP的来源，同时有文献表明，除了碳青霉烯耐药的肠杆菌科细菌（CRE），很多病原体所引起的医院感染暴发跟水槽有关系。因此医院规定在消毒水槽的同时，禁止将洗手池用于倾倒患者体液。事件后续：半年以后水池采样进行CRKP检测，结果为阴性。此外，在成都开展了多中心的研究，调查水槽污染问题，对16家医院的ICU进行采样，发现污染率比较高，CRKP检出率7.6%，这个多中心的研究，发现水槽是CRKP暴发的重要来源，但不是主要来源。此次调查和研究证明，基因组测序能解决实际问题。
[*]追踪耐药菌的院内传播。团队针对耐药菌在新建ICU中的传播进行了调查。经过半年的研究发现，在新建ICU中同时引入18个克隆（包括14个ST11和几个其他菌），但真正形成传播的、能够人传人的只有几个非常少的克隆。其中两个克隆在里面形成了3个或者3个以上的人的传播，且在环境里面持续时间比较长，主要跟两个住ICU时间比较长的患者有关系。此现象提醒我们如果只有一个单间，应该让需要长期住院的患者住进去，而不是把CRKP的患者安排进去。因为绝大多数的CRKP克隆，不会造成非常持久的传播，而将超级污染者即住院时间很长的患者隔离起来保护，防控的意义可能更大。
总 结
研究和调查需要有实际的指导意义；基因组测序是发展的趋势，感控可主动拥抱；基因组测序联合环境采样、主动筛查、病例调查可最大化指导多重耐药菌的防控；希望mNGS能深化，除了病原菌本身，还要能分析主要病原菌的遗传背景；mNGS将来要提升技术服务能力。
封面图片来自网络
图文：王小虾
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