【感染科普笔记2023-6-9】魏莲花丨阳性血培养液直接快速药敏试验（RAST）的解读及技术
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讲者丨魏莲花（甘肃省人民医院）
整理丨刘安云（皖南医学院第二附属医院）责编丨蓝雪0816来源丨2022 SIFIC暨OCAMRI联合会
“提高住院患者抗菌药物治疗前病原学送检率”是2021年、2022年国家医疗质量安全十大改进目标之一，越来越受到关注和重视。作为无菌标本的血培养，是最具价值的诊断标本，是诊断血流感染、菌血症的金标准。在每天接受大量血培养的同时，微生物实验室人员希望通过血培养直接药敏试验，第一时间为临床医生提供用药指导，而临床医生也渴盼微生物实验室能及时为感染患者的临床治疗指明方向。那么，如何对常见病原菌进行血培养直接药敏试验？如何理解血培养瓶直接快速药敏试验（RAST）中的技术不确定性？在2022年SIFIC年会上，来自甘肃省人民医院的魏莲花演讲的《抗微生物药物敏感性试验体系——EUCAST应用工具篇》为大家揭晓答案。一、《抗微生物药物敏感性试验体系——EUCAST应用工具篇》简介《抗微生物药物敏感性试验体系——EUCAST应用工具篇》是由杨启文教授和徐英春教授联合主译，内容包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、尿肠球菌、肺炎链球菌等8种临床常见血流感染致病菌阳性血培养液直接快速药敏试验(RAST)的抑菌圈直径折点。
（一）EUCAST应用工具篇应用说明
[*]应使用EUCAST快速药敏试验(RAST)抑菌圈直径折点表，解释通过EUCAST RAST方法获得的结果。
[*]折点具有菌种和孵育时间特异性，不得用于本书中表格中未包含的菌种和/或孵育时间。
[*]由于孵育时间越短，敏感和耐药菌株越难区分，因此，所有微生物-药物组合都存在药敏结果不确定的区间，EUCAST将该区间称为技术不确定区(ATU)。
（二）如何理解血培养瓶直接RAST中的技术不确定性？技术不确定区(ATU)：一般列出1～3mm的抑菌圈直径范围。采用EUCAST RAST方法时，所有微生物-抗微生物药组合都存在ATU。ATU代表了敏感性分类区分效果不佳的区域，该区域的解释错误概率急剧上升，因此应避免解释。一般而言，孵育时间越短，结果归属ATU分类的比例越高。
（三）处于ATU时如何应对？处于ATU内的检测结果无法进行解释，若不能可靠地判读抑菌圈或抑菌圈处于ATU,需要直接将该药物的分类留空白，在10分钟内重新孵育平板，并在6小时和8小时(如需要)时再次判读，不接受平板孵育时间超过8小时的解释；若孵育8小时后仍无法获得完整结果，则通过EUCAST标准纸片扩散法进行AST。建议实验室在血培养阳性报告上增加一条评论，解释为何有些结果在某些时候可能留空白。该评论为：“血培养阳性瓶直接药敏试验的结果一般在4、6和/或8小时后提供，前提是仅报告可靠的结果，短期孵育的敏感性报告如含有空白结果，可能会在之后提供更多结果”，便于临床医生理解。
二、欧洲抗微生物药物敏感性试验委员会血培养瓶直接RAST标准
[*]本标准是血培养瓶接种QC菌株时RAST方法的QC标准第3.0版，自2021年01月01日起生效。
[*]EUCAST推荐每日用标准方法进行常规QC或至少每周4次，是为了控制RAST材料和标准化纸片扩散法药敏程序的质量。
[*]表格采用3种QC菌株RAST程序，即直接从血培养瓶取样接种至纸片扩散平板，并孵育4、6和8小时。在培训新员工或血培养系统发生变化或该系统发生任何其他变化后，实验室进行该方法时需要采取室内质控。
*向血培养瓶内接种1mlQC菌株混悬液(100～200CFU/L》，并加入大约5mL无菌马血或绵羊血对QC菌株进行试验。将接种后的培养瓶置于血培养仪内孵育，并在得到阳性信号后根据RAST方法进行处理。
三、不同病原菌阳性血培养液直接快速药敏试验(RAST)抑菌圈直径折点（一）大肠埃希菌血培养瓶直接RAST的抑菌圈直径折点EUCAST血培养阳性瓶直接快速纸片扩散法药敏试验
[*]培养基：Mueller-Hinton (OMH)琼脂。
[*]接种量：从血培养阳性瓶中直接取125士25uL。
[*]孵育：空气，35土1℃。
[*]孵育时间：4、6和8小时。
[*]判读：取下平板盖，在黑色背景下，用反射光从正面判读抑菌圈边缘进行RAST的QC。
注释：
[*]头孢菌素对大肠埃希菌的折点将检出所有重要的耐药机制。存在或不存在ESBL本身并不影响敏感性分类，但出于公共卫生和控制感染的目的，推荐进行ESBL检测和表型检测，筛查临界值参见EUCASTRAST附药机制筛查文件。
[*]碳青霉烯对大肠埃希菌的折点将检出所有临床上重要的耐药机制。存在或不存在碳青霉烯酶本身并不影响敏感性分类，但出于公共卫生和控制感染的目的，推荐进行碳青霉烯酶检测和表征，筛查临界值参见EUCASTRAST耐药机制筛查文件。
[*]氨基糖苷类药物折点区分非耐药和耐药菌株。对于血流感染，EUCAST推荐氨基糖苷类药物和其他活性药物联合治疗。
（二）铜绿假单胞菌血培养瓶直接RAST的抑菌圈直径折点除孵育时间为6和8小时（无4小时！），其他血培养阳性瓶直接快速纸片扩散法药敏试验无区别注释：
[*]“S≥50mm”的抑菌圈直径折点为特定的超范围抑菌圈直径折点，旨在防止将菌株归入“S”类别。抑菌圈直径大于ATU区的菌株应报告“敏感,提高暴露量”。
[*]氨基糖苷类药物折点可区分非耐药和耐药菌株。对于血流感染，EUCAST推荐氨基糖苷类药物和其他活性药物联合治疗方案。
（三）鲍曼不动杆菌血培养瓶直接RAST的抑菌圈直径折点注释：
[*]“S≥50mm”的抑菌圈直径折点为超范国抑菌圈直径折点，旨在防止将菌株归入“S”类别。抑菌圈直径大于ATU区的菌株应报告。
[*]氨基糖苷类药物折点可区分非耐药和耐药菌株。对于血流感染，EUCAST推荐氨基糖苷类药物和其他活性药物联合治疗。
[*]在外缘判读抑菌圈直径，忽略抑菌圈内生长的细菌。
（四）金黄色葡萄球菌血培养瓶直接RAST的抑菌圈直径折点注释：
[*]对于头孢西丁敏感菌株，报告所有在EICAST临床折点表(标准方法)中的β-内酰胺类药物敏感(包括带有“注释”的药物)。如果甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌需报告头孢噻肟和头孢曲松敏感性，则应报告为“敏感，提高暴露量”；对头孢西丁耐药的菌株可能对甲氧西林耐药，因此报告对所有β-内酰胺类药物(可能头孢洛林和头孢比普除外)耐药。
[*]可用诺氟沙星纸片扩散法筛查氟喹诺酮耐药性。对诺氟沙星敏感的菌株可报告为对莫西沙星敏感(S)，对环内沙星、左氢氟沙星和氧氟沙星“敏感，提高暴露量”（Ⅰ），应对耐药菌株进行各种药物的敏感性检测，如情况紧急，则报告所有药物耐药(R)。
[*]庆大霉素折点可区分非耐药和耐药菌株。对于血流感染，EUCAST推荐氨基糖苷类药物和其他活性药物联合治疗。
[*]诱导型克林霉素耐药性试验：放置1张克林霉素2μg纸片和张红霉素15μg纸片，二者间隔6～12mm(边缘至边缘的距离)。6和8小时后观察D现象。阳性试验结果可信，但阴性试验并不保证不存在诱导型耐药。注：在测量克林霉素抑菌圈直径时，应单独进行额外的克林霉素纸片扩散试验，避免红霉素纸片产生的干扰。
（五）肺炎链球菌血培养瓶直接RAST的抑菌圈直径折点注释：
[*]对于苯唑西林敏感菌株，报告所有在EUCAST临床折点表(标准方法)中的β-内酰胶类药物敏感(包括带有“注释”的药物)。若苯唑西林抑菌圈直径≥8mm(4、6和8小时的折点有相同)，则报告氨苄西林，阿莫西林和哌拉西林(联合和不联合β-内酰胶酶抑制剂)，头孢噻肟、头孢曲松、头孢罗林、头孢比普和头孢吡肟敏感。否则，对相关药物进行标准试验。
[*]对于脑膜炎，苯唑西林敏感菌株应报告在EUCAST临床折点表(标准方法)中有脑膜炎折点的所有β-内酰胺类药物敏感。对于苯唑西林耐药菌株，报告苄青霉素耐药；对于其他药物，考虑用于临床的药物进行MIC测定。
[*]可用诺氟沙星纸片扩散法筛查氟喹诺酮耐药性。对诺氟沙星敏感的菌株可报告为对莫西沙星敏感(S)，对环丙沙星、左氧氟沙星和氧氟沙星“敏感，提高暴露量”(I)，应对耐药菌株进行各种药物的敏感性检测，如情况紧急，则报告所有药物耐药(R)。
[*]诱导型克林霉素耐药性试验:放置1张克林霉素2ug纸片和1张红霉素15μg纸片，二者间隔6～12mm(边缘至边缘的距离)。6和8小时后观察D现象，阳性试验结果可信，但阴性试验并不保证不存在诱导型耐药。注意：在测量克林霉素抑菌圈直径时，应单独进行额外的克林霉素纸片扩散试验，避免红霉素纸片产生的干扰。
四、抗菌药物敏感性试验的技术不确定区(ATU)
[*]技术不确定区(ATU)是EUCAST提出的专业术语，向实验室提示抗微生物药物敏感性试验(AST)存在结果无法判定的警告信息。采用EUCAST方法和折点时，MIC测定或纸片扩散可能存在这种情况。
[*]ATU可以由1个(或偶尔多个)MIC值或1个(或1个范围)抑菌圈直径界定。ATU并不属于S、I和R的药敏试验分类，也不影响结果解释。
[*]ATU向实验室检测人员发出警告，该数值处于结果难以解释的区域，原因是该折点位置的解释无法重复确认。尽管天然存在的不可避免的检测变异性会影响可能需要采取的措施，但ATU与这种检测程序的不确定性无关。对于ATU并不存在强制采取的措施，可忽略该警告，或针对该警告采取措施。进行替代试验偶尔能解决该问题，否则必须做出决定，按检测结果报告并添加/不添加警告信息，或不报告该结果的敏感性分类。
3.1如决定针对该警告采取措施，则表示有多种替代方案，而且每种替代方案合适与否将取决于鉴定出微生物的样本(例如UTIvs.败血症)和可用的替代抗微生物药物。当结果处于ATU时,实验室技术员可与医疗人员商议讨论药敏试验结果。
[*]重复试验——在有理由怀疑存在技术错误时才进行。
[*]替代试验(进行MIC、PCR、耐药机制检测)——在替代试验可得出确定性结果时才有意义(例如通过PCR对葡萄球菌检测mecA或mecC基因，对肠球菌检测vanA或vanB基因)。
[*]将处于ATU结果报告为“不确定”，并附一条评论：
（1）在报告中接受并包含结果解读，但增加一条警告信息；（2）在报告中的解读部分留空白，并增加一条解释。
[*]将处于ATU结果报告为“R”。若药敏报告中有多种更好的替代治疗药物选择，这可能是最轻松且最安全的选择。
[*]抓住机会和临床医生讨论结果。
3.2如决定忽略警告，则根据所得结果(MIC或抑菌圈直径)进行解释，ATU不影响结果的解释。ATU警告信息在EUCAST折点表中列出，随着折点更新，ATU可能会发生变化。具体信息如下图：
小 结
[*]血培养液直接快速药敏试验是微生物室亟需开展的实验。
[*]《抗微生物药物敏感性实验体系EUCAST应用工具篇》的出版发行为微生物实验室提供了有力的工具。
[*]该工具书涉及内容多，需要不断学习，才能指导临床实践应用。
封面图片来自网络图文：王小虾
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