【感染科普笔记2022-10-24】鲍容丨非结核分枝杆菌实验室鉴定与药敏试验
本帖最后由 999欣欣向荣 于 2024-9-26 11:49 编辑鲍容丨非结核分枝杆菌实验室鉴定与药敏试验https://mp.weixin.qq.com/s/DwECsX1Ob6ICN8uMuajqIQ
讲者丨鲍容（复旦大学附属中山医院）
整理丨周洋（无锡市中医医院）审核丨蓝雪0816来源丨2021年SIFIC全国感控与耐药感染大会随着结核病疫情的有效控制，新的诊断技术水平不断提高，更多的NTM感染被鉴定出，人们也重新认识到NTM感染的重要性，确认了NTM可感染肺部、皮肤、骨骼、淋巴结等组织和器官，由此导致相应部位的非结核分枝杆菌病发生。2021年的全国感控与耐药感染大会上，来自复旦大学附属中山医院鲍容老师通过分享非结核分枝杆菌实验室鉴定与药敏试验鉴定方法，为提高实验室对NTM的检验能力，以便为更好地服务于临床提供参考。
非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM），是指除结核分枝杆菌复合群（MTC，包括结合、牛、田鼠、非洲、pinnipedii、suricattae和mungi分枝杆菌）和麻风分枝杆菌以外的一类分枝杆菌的总称。曾用名为非典型分枝杆菌、非典型抗酸杆菌、非分类分枝杆菌、未分类分枝杆菌、无名分枝杆菌、野种分枝杆菌、机会性分枝杆菌、副结核分枝杆菌、假性结核菌。迄今为止，共发现NTM菌种190余种，14个亚种。大部分为寄生菌，仅少部分对人体致病，属条件致病菌。NTM病指人体感染了NTM，并引起相关组织、脏器的病变。近年来，NTM病呈现快速增多趋势，已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题之一。
全球呼吸道NTM分离各有差异。四种临床常见分离率较高的NTM种类包括鸟胞复合群、脓肿分枝杆菌、戈登分枝杆菌和偶发分枝杆菌。国内NTM检出率、主要菌种的构成比不一样，主要是南方地区偏多一些。
实验室鉴定方法1.标本送检包括肺内和肺外标本，如痰液、支气管也、支气管肺泡关系也、肺活检组织、淋巴结活检组织、血液、骨髓分泌物、体液等。
如果为了诊断，则要求留取多份标本，而且不同标本不能在同一天采集。临床标本应在采集24小时内进行监测（若不能及时处理，应置于4℃保存）。不应使用口咽拭子培养或血清学检测结果诊断NTM病。避免服用抗菌药物，尤其是大环内酯类、喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶及利奈唑胺等药物。如正在使用这些药物，建议必要时停药至少2周后再采集标本。
2.涂片显微镜检查
[*]抗酸染色：抗酸阳性杆菌，着色均匀，呈束状或团状排列。简便、快速、价廉、可长期保存。
[*]荧光染色：紫外光源，黄绿色荧光，呈杆状或分枝状。
[*]分离培养：固体培养：L-J培养基、7H10培养基
[*]液体培养：MGIT960液体培养基。
3.初步菌种鉴定（能鉴别结核和非结核分枝杆菌）:对硝基苯甲酸（PNB）选择性培养基法、MPB64抗原检测、核酸扩增试验。
4.NTM菌种鉴定（鉴别至种水平）：（1）分子诊断技术，包括：①直接的同源基因或序列比较方法（金标准）。②间接的同源基因或序列比较方法。③二代测序技术：对于普通细菌，可在≤48h内出结果，灵敏度和特异度由于传统培养，NTM的mNGS阳性率不理想，肺泡灌洗液相对效果较好。（2）质谱技术——依据细菌结构差异进行菌种鉴定。该方法具有分辨率高、快速、准确、需要菌量少的优点。（3）核酸质谱技术：一种简单、快速、多重的检测方法。
体外药物敏感性试验对具有显著临床意义的分离株进行药敏试验，排除环境菌和污染菌。菌种鉴定的基础上开展NTM药敏试验，推荐标准是微量液体培养稀释法。慢生长NTM推荐使用含OADC的CAMHB液体稀释法，使用合适抗生素治疗6个月后，仍无法根除快生长NTM（呼吸道除外）都需要进行菌种鉴定及重复药敏试验。
1.非结核分枝杆菌MIC药敏试验微量肉汤稀释法，12-15中药物，每种药物7-8个浓度，全值MIC检测，判读清晰简便。
2.药敏试验操作步骤（1）所有肉汤静置至室温。（2）使用无菌拭子蘸取几个形态一致的待测菌落。（3）将菌落转移至含4.5mL无菌水和无菌玻璃珠的试管中，使用浊度计调整浊度至0.5 McFarland 标准浊度。（4）菌悬液旋涡震荡15-20秒，静置，使得残留的大菌块沉降至管底，取均匀菌悬液作为接种用。（5）移取50μL上述菌悬液至含有阳离子调节的10mL CAMHB溶液中，将管子倒置8-10次，充分混合（6）混匀后，将管子放入自动加样仪中，或用适当移液器进行手动加样。（7）将加样量调到100μL后，仪器自动或手动加入96孔药敏板中。（8）完成接种后，用粘性密封膜覆盖药敏板所有微孔，置于培养箱中孵育。
3.药敏板结果判断
4.RGM药敏试验结果判读与报告（1）应在48h后检査，对偶发分枝杆菌、耻垢分枝杆菌以及其他几种色素 RGM 特别有帮助。（2）如果在质控孔菌株生长（表现为浊度或孔底的细胞沉积）是足够的（即，至少2+)，可以记录 MIC 值。否则，应该盖好盖子，重新孵育，并在第3天重新读取结果。（3）如果质控孔仍生长不足，则应在第4天再次读取结果。如果第5天的增长仍不足，应再次进行测试.（4）对于一些进行抗菌药物治疗的患者，在进行药敏试验之前，菌株可能需重复接种至固体培养基使其充分生长有助于获得足够的效果。（5）如果菌株五天内不能生长，应报告不能在可接受的时间内生长和／或送往参考实验室进行重复测试和（或）16S rRNA 和erm基因测序，分别测定阿米卡星和大环内酯的致感性。（6）若克拉霉素药敏孔3天后未出结果，可延长至第14天再次读取结果，以保证检测到诱导性大环内酯类耐药。复方新诺明应读取约80％抑菌率的 MIC 值。（7）其他药敏结果最后的阅读时间不应超过五天（8）个别脓肿分枝杆菌复合群分离株在肉汤中生长非常缓慢，即使经过多次尝试，对于这些分离株培养长达14天可能是足够生长所必需的，然而，由于RGM推荐的几种抗菌药物的不稳定性，只有克拉霉素和阿米卡星可以在5天后可靠地报告结果。（9）克拉霉素有两种不同的耐药机制，即获得性（突变的）和诱导性耐药。由于23S rRNA 基因中腺票呤2058或2059（大肠杆菌编号）的单个碱基对突变而产生大环内酯耐药性。另一种由一个完整的erm(41)T28序列，其特征是在第28位发生C到T的替换，赋予诱导性克拉霉素抗性。
5. SGM药敏试验结果判读与报告（1）药敏试验板应在7天后检查。（2）如果增长不佳，应重新培养，并在10至14天后再次阅读。（3）复方新诺明读取80％抑制孔位，其他药物读取第一个不生长的孔位。（4）应在7天后检査M.marinum的结果。在7到14天后，应检查M.kansasii和大多数其他非苛性的sG 的结果。M.xenopi和M.malmoense可能需要孵育3-4周。
临床沟通NTM发病率呈上升趋势，实验室处理NTM技术相对落后、NTM对抗结核药物天然耐药率高，临床对NTM感染的诊疗需求日益增加。实验室应加强临床沟通，提高特殊病原体鉴定与药敏检测能力，助力临床诊疗。
小 结NTM感染呈上升趋势，仍需注意排除实验室污染及定植菌。NTM种类繁多，商品化分子生物学技术可直接对临床标本进行检测，纯培养可用于MALDI-TOF MS和药敏试验。
不同NTM抗菌药物敏感性各异，菌株需鉴定至种和亚种水平。正接受治疗的NTM肺病患者的分离株建议冻存，以便再复发时与再感染进行区分。NTM的耐药性和敏感性试验知之甚少，需要遵循推荐建议。RGM对克拉霉素和阿米卡星耐药率较低，对利奈唑胺耐药率高。实验室应加强临床沟通，提高特殊病原体鉴定与药敏检测能力，助力临床诊疗！
图文：王小虾
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