【感染科普笔记2019-5-23】胡必杰丨二代测序技术（NGS）--抗感染精准治疗中的临床实践
本帖最后由 明丫头 于 2024-9-26 20:16 编辑胡必杰丨二代测序技术（NGS）--抗感染精准治疗中的临床实践
讲者丨胡必杰（复旦大学附属中山医院）整理丨宋慧敏责编丨吴怀英/米宏霏来源丨2018全国感控与耐药感染大会
在 2017年全国感控年会上，中华预防医学会医院感染控制分会主任委员、复旦大学附属中山医院胡必杰教授呼唤快速有效的病原学诊断---二代基因测序技术，直击中国感控要害。2018全国感控与耐药感染大会上胡必杰教授再次强调，感染性疾病的诊治，降低感染的病死率，改善预后的最核心问题依旧依赖于快速、准确的病原体诊断，同时分享了1年来使用微生物最新检测技术---二代基因测序技术（NGS）在抗感染精准治疗中的临床实践体会。https://bbs.sific.com.cn/data/attachment/album/201906/02/204426kd8obsfkobrg5ggn.jpg一、目前抗感染治疗过程中使用抗生素常见的错误
[*]将非感染病误判为感染病，而使用抗生素；
[*]病原体种类判断错误，选择无效的抗生素；
[*]病原体耐药判断错误，选择不敏感的抗生素；
[*]经验性选药，过度追求病原体的广覆盖；
[*]微生物检验报告单解读错误；
[*]未能按照PK/PD原理，制定合适给药方案；
[*]抗感染疗程过长；
[*]成本效益分析，优化药物选择考虑不足。
二、国内微生物检测的现状与方向目前临床面临的状况是病原体越来越复杂，耐药情况越来越严重，对微生物实验室的质量要求越来越高。细菌学检测技术的发展方向：
[*]MALDI-TOF：已经在很多医院开展，可以缩短细菌的鉴定时间，更是可以直接缩短微生物血培养时间；
[*]自动化的微生物检测技术：优化流程，缩短报告时间；
[*]基因检测技术：宏基因组测序---二代测序技术。
三、国际视野2018年ECCMID年会：微生物和感染控制需要密切结合，并报道了基因的监测技术，尤其是二代测序技术在控制细菌感染中的应用。二代测序技术具有简便、快速、灵敏度高、对微生物的检测覆盖面广的优势，对微生物的追踪很有意义。二代测序技术目前影响推广最核心的问题是价格昂贵。如果技术推广、价格降低，您做好解读复杂微生物报告单的准备了吗？
https://bbs.sific.com.cn/data/attachment/album/201906/02/204427ps3z03xxuizfk9uq.jpg
四、二代测序技术应用在上海中山医院1000多例临床实践案例分享意料之外、情理之中——肺诺卡菌病的诊断
案例一女62岁，反复发热咳嗽、咳痰7月，最高体温达39.5℃，多次痰培养铜绿假单胞菌；抗感染治疗后热退，停药后病情反复，发热间歇期逐渐缩短。对支气管肺泡灌洗液（BALF）行宏基因检测，提示诺卡氏菌感染。后与微生物实验室沟通延长标本培养时间，7天后报告诺卡氏菌。抗感染治疗方案改为亚胺培南+复方SMZ，10天后复查CT提示炎症明显吸收，出院改为口服复方SMZ+利奈唑胺治疗，疗程3个月，未再复发。
案例二男65岁，反复发热、咳嗽伴痰血8年，CT显示：双肺多发斑片斑点影。先后予抗结核、抗真菌和激素治疗，病情反复。2017.10.22再次出现症状，痰涂片找抗酸杆菌2+，ESR 31mm/H；肺泡灌洗液mNGS提示诺卡菌生长（华莱士诺卡菌），痰涂片抗酸杆菌1+，。治疗1个月后门诊随访，患者咳嗽咳痰明显好转，再无发热和咳血。病人表示8年来从未感到呼吸如现在这般顺畅，复查胸部CT示，肺病灶大部分吸收，炎症标志物下降至正常：CRP 1mg/L，ESR 10mm/H。
案例三男35岁，2017年12月初出现发热、Tmax 40℃，伴咳嗽咳痰（黄脓痰），盗汗。外院予抗感染治疗（头胞哌酮舒巴坦+左氧氟沙星、莫西沙星+奥司他韦等），症状反复无缓解，精神萎靡，纳差，2个月内体重下降14kg。2018年1月18日入中山医院。入院后诉头痛，伴恶心，肺部CT：两肺炎症伴实变、不张，头颅MR：脑内广泛多发病变，病灶周围明显水肿。常规微生物学检查均无阳性结果。脑脊液、肺组织匀浆的mNGS：提示诺卡菌感染。治疗：利奈唑胺0.6g q12h+SMZ 1.44g tid+美罗培南2g q8h。患者头疼缓解，未再发热。复查胸部CT：两肺病灶较前吸收好转，头颅MR：脑内广泛多发病变较前吸收，水肿范围缩小。针对脑部诺卡菌治疗需延长到6月。
感慨：由于常规微生物检测技术的限制，导致无法及时发现诺卡菌。这些案例说明，诺卡菌病已经不是罕见疾病了。
从基因水平提供病原学依据---大大缩短诊断时间
案例四女23岁，学生，发现右侧颈部肿块1月。T-SPOT A/B: 35/19，临床考虑颈部淋巴结结核。传统方法始终未获取病原学依据。颈淋巴结穿刺第二天，颈淋巴结穿刺脓液mNGS提示：结核分枝杆菌感染。淋巴结清创术后第3天，颈部组织mNGS：结核分枝杆菌。
案例五男27岁，右肋腰部肿块2月，T-SPOT A/B: 69/13, 右侧腰部脓肿穿刺，较多凝固性坏死及中性粒细胞，结核坏死不能除外，抗酸（-）穿刺液涂片找抗酸杆菌（-）;。右侧肋腰部脓液涂片找抗酸杆菌和分支杆菌培养各5次均为阴性；痰找抗酸杆菌的分支杆菌培养各1次，均阴性。不同部位标本mNGS提示结核分枝杆菌感染。
案例六女79岁，Tmax 38.8℃，咳嗽咳痰，发热4天。2017.9.2肺部CT提示：两肺轻度多发感染灶，怀疑结核或者真菌感染，2017.9.6肺部CT：两肺多发感染灶明显加重，支气管镜检查管腔内见较多脓性粘稠分泌物，灌洗液及咳出物：抗酸杆菌（+）。9.10肺泡灌洗液NGS结果提示：鸟分枝杆菌。9.15肺泡、肺组织分枝杆菌培养陆续报告阳性10.24微生物回报：胞内分枝杆菌。因NTM生长较慢，并有杂菌污染，多次药敏试验失败。https://bbs.sific.com.cn/data/attachment/album/201906/02/204428an5rn8zrnrjo4vzx.jpg
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案例七男45岁，体检发现左下肺结节2月，无发热、咳嗽、咳血、乏力盗汗等。9.29CT左下肺结节1.2cm。WBC9.96，N67.4。给予头孢呋辛+阿奇霉素治疗；10.18隐球菌荚膜抗原1:80，改用氟康唑0.4 qd。11.18、11.27CT较前进展，WBC 7.86，N65.3%,，ESR32，CRP 8.0，PCT 0.19，G/GM:(-),T-SPOT61/42。提示：结核？隐球菌？氟康唑耐药？结果肺穿刺组织培养：新型隐球菌，mNGS：隐球菌属。https://bbs.sific.com.cn/data/attachment/album/201906/02/204431f4k88mm34pmkgm38.jpg
案例八男56岁，左下肢红肿3周，皮肤水泡破溃1周，重症肌无力，胸腺瘤切除术后4年。2018.2.18出现左小腿外侧和左外脚踝处皮肤发红，范围逐渐增大，皮温升高，伴疼痛。3月初出现绿豆大小透明水疱。外院予哌拉西林他唑巴坦、头孢米诺治疗，红肿无好转，疼痛明显。3月11日胸部CT：右肺小结节，两肺散在少许慢性炎症及陈旧灶。3月13日左小腿皮肤红肿、右腋窝结节。3月16日小腿皮肤组织NGS：新生隐球菌。小腿皮肤活检标本真菌培养：新生隐球菌。左小腿皮肤活检病理符合真菌感染，隐球菌感染可能性大。
感悟：在隐球菌病确诊12例中NGS检出6例，检出率50%。2例肺组织匀浆，4例BAL。这些数据告诉我们，二代测序技术在检测真菌方面同样具有一定的意义。
二代测序技术---不同部位、不同标本中大显身手
案例九男56岁，发热咳嗽咳痰23天。肺部CT变化见下图：
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痰培养（3-7天）：烟曲霉，mNGS:（48小时）：烟曲霉。给予伏立康唑静滴+两性霉素B雾化吸入+糖皮质激素抗炎。起始卡泊芬净联合治疗12天，好转出院。
案例十男41岁，咳嗽咳痰20年，间断痰血5年，加重5天。2017.10.27、10.29、10.31痰标本：涂片找细菌、真菌、抗酸杆菌均为（-），培养（-）。10.27肺泡灌洗液：细菌、真菌、曲霉、分枝杆菌培养（-）。GM试验0.77ug/L，烟曲霉lgG抗体>500AU/ml，烟曲霉lgM抗体<31.25AU/ml。10.29肺泡灌洗液NGS检测：肺曲霉菌。10.31予伏立康唑0.2 q12h，症状好转，痰血停止。
案例十一女53岁，反复咳嗽、咳痰4年余。
https://bbs.sific.com.cn/data/attachment/album/201906/02/204433j53tq1mpr5mmr5s3.jpg初步考虑隐球菌感染。送检痰液mNGS结果：第二天回报曲霉菌。此病例让我们对曲霉菌感染的影像学有了不同认识。
NGS在曲霉感染中的应用情况：怀疑曲霉菌感染患者44例，送检标本81份。血液标本5份、呼吸道标本76份。诊断烟曲霉感染17例（包括病理阳性）。NGS与常规培养方法阳性率比较：NGS阳性率85.2%，真菌培养阳性率51.6%，NGS检测的敏感性更高。
病例十二医院内获得性病毒感染https://bbs.sific.com.cn/data/attachment/album/201906/02/204435sotozotmz4nmoo70.jpg
病例十三男54岁，反复关节疼痛8年，加重伴红肿2周。血WBC 19.79，N 90.9%; ESR 78mm/H, CRP242mg/L, 12月5日局部脓肿行穿刺抽液送微生物涂片+培养及二代测序。二代测序结果：军团菌属，见下图https://bbs.sific.com.cn/data/attachment/album/201906/02/204436mayedtcaqykyeedi.jpg
案例十四男54岁，反复咳嗽伴咳血1年，右胸壁肿物3月余。血WBC 12.54. N 77.8%。CRP 75.8mg/L, ESR 76mm/H ,PCT 0.12ng/ml。T-SPOT A/B：1/0 。痰涂片、伤口脓液找细菌、真菌、抗酸杆菌均无结果。9月15日腹盆增强CT：右侧多个胸腹壁肿物。9月22日mNGS:考虑肺部厌氧菌（具核梭杆菌、福赛斯坦纳菌和牙龈卟啉单胞菌）混合感染，继发脓胸、胸壁脓肿，给予哌拉西林/他巴唑+左奥硝唑治疗后痊愈，具体检验治疗结果见下图：https://bbs.sific.com.cn/data/attachment/album/201906/02/204437rd6wysahsdfsmhbi.jpg
案例十五男51岁，右侧胸痛1周，WBC 11.78x109/L, N 83.4%,CRP204.4mg/L, ESR 78mm/H ,血培养（-），胸部CT：右下肺团片影，右侧少量胸腔积液。18年1月23日，B超引导下引流45ml棕黄色脓臭液体，微生物涂片、培养均阴性，1月25日mNGS诊断：右肺脓肿（产线菌属及具核酸杆菌感染）。
案例十六男43岁，反复咳嗽咳痰5年余。脓液培养：溶血链球菌。mNGS检测出传统难以生长的厌氧菌，诊断：左肺慢性肺脓肿（普氏菌等厌氧菌混合感染）。
小结脓液标本的培养vs二代测序技术（NGS）
[*]二者临床符合率较高，但NGS不能提示药敏，对普通细菌优势不明显；
[*]对于临床怀疑特殊病原体，尤其是普通培养阴性或者经验性治疗效果不佳者，推荐NGS，有助于指导治疗及早期治疗。
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感悟宏基因检测技术为感染性疾病的病原学诊断打开了一扇门，虽然它不能解决所有的病原学诊断问题，但目前的宏基因监测技术，可以解决部分疑难感染的病原学诊断，缩短感染病确诊时间，尽快目标性抗感染治疗，改善患者预后。随着基因检测技术的发展，人们对检测报告单的正确解读，我们有理由相信感染性疾病的病原学诊断和鉴别诊断会越来越好！
图文编辑：王小虾
宏基因检测技术为感染性疾病的病原学诊断打开了一扇门，虽然它不能解决所有的病原学诊断问题，但目前的宏基因监测技术，可以解决部分疑难感染的病原学诊断，缩短感染病确诊时间，尽快目标性抗感染治疗，改善患者预后。学习了！
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