抗菌药物敏感性试验发布时间：转帖
2011年5月13日抗菌药物敏感性试验通常用于检测被分离的各种病原菌对抗菌药物的敏感或耐药的程度，为临床正确合理地选用抗生素治疗提供科学依据。准确的药敏试验对于临床选择适当的抗微生物药物非常关键。卫生部建议目前我国抗生素药敏试验应当参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI／NCCLS)文件进行。1999年我国卫生部制定了《纸片法抗菌药物敏感试验标准(SAST)》，并于2000年5月1日颁布实施。该标准是我们临床微生物工作者必须遵循的基本法规。我国临床微生物学家陈民钧教授等自20世纪90年代初开始引进美国NCCLS药敏试验标准，并且每年根据新版及时做出更新要点报道，指导我国临床微生物室药敏试验工作，使我国细菌药敏试验逐步走向标准化和规范化。
常用的药敏试验方法有琼脂扩散试验(K．B法)和稀释试验定量测定最低抑菌浓度(MIC)。
近年来，在抗菌药物敏感性试验方面，发展应用：分子生物学技术，检测临床分离菌株的耐药基因，为临床药敏试验提供了更为简便、快速、准确、可靠的试验方法。
[*]药敏试剂和方法标准化
准确的药敏试验首先要有标准的药敏检测试剂，包括药敏纸片和培养基等，其次要求药敏试验方法的标准化。对此，我国SAST和美国NCCLS对药敏纸片的各种抗生素含量和使用的培养基等都有严格的规定，要求临床微生物实验室必须遵循这些基本法则。标准要求药敏试验必须使用有国家食品药品监督管理局(SFDA)或美国食品药品管理局(FDA)批准的药敏试剂。
1、纸片琼脂扩散法(K—B法)选用M—H琼脂培养基，适合快速生长的致病菌，对于苛养菌则需使用嗜血杆菌专用琼脂平皿(HTMA／GCA)。K．B法简便、经济，但应注意不是所有细菌都适合用该方法检测耐药性。发酵菌K—B法药敏试验只适用铜绿假单胞菌和不动杆菌属的判断标准，其他非发酵菌，如嗜麦芽窄食单胞菌等建议用最低抑菌浓度(MIC)法检测耐药性，以避免误导临床错用抗生素。此外，如果考虑为多重耐药致病菌，还需要进一步确定各种药物的MIC，以保证临床用药的有效性。
2、液体稀释法用于测定MIC、MBC(最小杀菌浓度)、MIC(能抑制50％试验菌的MIC)和MIC(能抑制90％试验菌的MIC)。液体稀释法比较繁琐，一般不作为常规试验。通常用于调查罕见耐药，调查药敏定性试验结果敏感，但临床疗效不佳的原因，确定中介度的敏感性，有效地选择二线药，评价新药。MIC药敏测定必须关注的是在培养基制备和测定过程中药物的失活，在不同培养基中，因为成分和制备过程中药物变化程度不同出现不同的MIC。
3、浓度梯度法(E—test)是一种新型的检测细菌或真菌对抗菌药物敏感性的方法，主要包括一个含有连续抗菌剂梯度的试条。该法与微量稀释法具有良好的一致性，只是浓度梯度(E．test)法所测MIC值普遍略高于微量稀释法，可能与E—test法所采用的连续抗菌剂梯度，以及椭圆抑菌环内有微小菌落存在，导致终点判读误差所致。E—test法药敏试验对于探讨耐药机制，准确鉴定耐药性，指导临床合理使用抗生素治疗，对大量使用抗生素的医院选药监测和对新抗生素的评价具有重要意义。
4、联合药敏试验对临床上病原菌不明的感染、单一药物不能控制的混合感染、全身性铜绿假单胞菌感染、长期用药可能产生耐药的感染(结核、慢性骨髓炎)和病原菌为多重耐药菌株等，宜作联合药敏试验。
5、药敏试验的药物选择为了使药敏试验结果符合临床实际需要，在我国SAST和美国NCCLS标准中，根据临床分离的病原菌类型，对药敏试验的药物选择做了具体规定，并按最新资料每年修正公布。药敏试验中药物选择原则应根据不同菌种选择相应的抗菌药做药敏，而且抗菌药物的选择必须合理，并要经济实用。
6、实验操作规范化现代微生物实验室的自动化、电脑化及微生物微量生化反应测试方法，可同时进行自动分析鉴定(ID)与药敏(MIC)检测，使细菌鉴定／药敏分析逐步走向规范化、标准化、现代化。此外，值得注意的是，要获得药敏试验的准确结果，还需遵守药敏试验的孵育温度范围：通常葡萄球菌属为33～35℃，不超过35℃，其原因是检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)，若孵育温度超过35℃可能会漏检。其他细菌的药敏试验孵育温度在(35±2)℃。测MRSA的温度以33～35℃最好，绝不能高于35℃。
二、药敏试验质量控制和质量评价1．质量控制质控是耐药性监测的基础，WHO推荐的软件WHONET．5可以对室内和室间质控进行评价。为保障药敏试验的准确性，应当每日对监测数据进行评估，首先要按照标准做好室内质控，并参与室问质评(包括卫生部临检中心和省临检中心)，将耐药数据与各种感染的发病率、流行率、预后联系起来，建立耐药数据与各种抗生素使用情况之间的关系，根据耐药数据，制订干预措施，控制抗生素的使用，并评价其效果。
2．质控试验频率按M100-S14有关质控方面的修改意见，药敏试验用品来自新邮件或新批号要进行一天质控试验；来自新厂家的MIC试验用品要进行20～30天质控试验。使用影响药敏试验的新软件要进行5天质控试验，而且要检测本室所有正在使用的抗生素。添加任何新的未曾用过的抗生素，需要有20～30天满意的质控试验结果。接种用种子测浓度的方法改变时要进行质控试验，从目测到光电比浊要质控5天。仪器修理好后质控一天。更换仪器硬件，如阅读器、保温箱，质控20～30天。这些试验亦可与常规药敏同时进行，质控结果合格，常规结果也合格。常规质控一般为每日或每周进行质控试验，以保证得到准确的结果。当质控结果可以接受时说明药敏试验所使用设备、试剂、培养基及耗材和试验过程是符合要求的。
三、药敏试验报告规则与药敏折点判断1．药敏报告规则通常分敏感、耐药、中度敏感3个档次。中度敏感或中介度，这一范围只是抑菌环直径介于敏感和耐药之间的缓冲域，以防止由于微小的技术因素失控所导致的较大的结果解释错误，抑菌环落人中介度范围，意义不明确，如果没有其他可以替代的药物，应重复或以稀释法测定MIC。一般认为药敏结果与临床约有80％～90％符合率，药敏试验是提供}台疗感染性疾病最有力的依据，了解耐药菌株的耐药机制，利用药敏谱可对被检菌株进行鉴定。
2．药敏折点判断据美国《NCCLS抗生素敏感试验实施标准M100-S14手册》中规定，超广谱β内酰胺酶(ESBLs)确证试验阳性时，产ESBLs菌要报告含头孢吡肟在内的所有青霉素类、头孢菌素类及氨曲南耐药。M100-S14手册还强调当前仍然坚持3种细菌(大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、产酸克雷伯杆菌)适用于ESBL确证试验规则，不能扩大到3种细菌之外。总之，细菌药敏试验标准化与规范化需要从多方面人手，从临床标本采集，病原菌分离培养与鉴定，药敏试剂合格、操作技术规范、质量控制严格，结果报告准确等各个方面加强。从事细菌学检验人员亦需不断提高自身素质，协助临床医生理解耐药性检测结果的意义，指导临床合理选用抗菌药物，最大限度地发挥细菌室在抗感染治疗中的作用。
四、抗菌药物敏感性试验方法1．纸片扩散法(K—B法)药敏试验把含有抗菌药物的圆纸片放在均匀地接种了实验细菌的琼脂平板上，抗生素的浓度梯度通过从圆纸片上扩散而形成。试验细菌的生长在圆纸周围一定距离处被抑制，抑菌圈的大小与细菌的敏感性有直接关系。回归曲线表明MIC的对数与抑菌圈的直径呈直线关系。
2．稀释法药敏试验分液体稀释法和琼脂稀释法两种，为了定量测定抗菌药物的活性，抗生素与肉汤或琼脂培养基混合进行稀释，然后种入被检测细菌，孵育过夜，观测结果：最低抑菌浓度MIC (minimalinhibitoryconcentration)是能够抑制细菌生长的最低药物浓度；最低杀菌浓度MBC (minimalbactericidalconcentration)是能够杀灭细菌的最低药物浓度；MIC如是能抑制50％试验菌的MIC；MIC。。是能抑制90％试验菌的MIC。
(一)纸片扩散法(K．B法)1．药敏纸片根据我国SAST《纸片法抗菌药物敏感试验标准》和美国《CLSI／NCCLS>>标准要求，需采用经国内SFDA或美国FDA批准有生产文号的药敏纸片。
2．药物选择为使常规药敏试验合理，应限制测定药物的数量。根据SAST标准，肠道病原菌药敏试验首选药物：A组作为常规首选药：包括氨苄西林(ampicillin)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢噻吩(cefalotin)、庆大霉素(gentamycin)；B组作为临床上重要药物的首选药：包括阿米卡星(amikacin)、阿莫西林一克拉维酸(ampicillin—clavulanate)或氨苄西林／舒巴坦(ampicillin／sulbactam)、哌拉西林／三唑巴坦(piperacillin／tazobactam)、替卡西林／克拉维酸(ticarcillin／clavulanate)、头孢孟多(cefamandole)或头孢呋辛(cefuroxime)、头孢美唑(cefmetazole)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢噻肟(cefotaxime)或头孢唑肟(ceftizoxime)或头孢曲松(ceftfiaxone)、环丙沙星(ciprofloxacin)或左氧氟沙星(L—ofloxacin)、亚胺培南(imipenem)、哌拉西林(piperacillin)、替卡西林(ticarcillin)、甲氧苄啶／磺胺甲嗯唑(SMZ—TMP，sulfamethoxazole—trimethoprim)等，报告条件是只有当A组中同类药物不敏感时才报告；C组为替代或后备药物，包括氨曲南(aztreonam)、头孢他啶(ceflazidime)、氯霉素(chloramphenic01)、卡那霉素(kanamyein)、奈替米星(netilmicin)、四环素(tetracycline)、妥布霉素(tobramycin)等。适用情况包括治疗某些地方性或流行性疾病，或对首选药(特别是同类药，如B-内酰胺类或氨基糖苷类药物)多重耐药菌株，治疗对首选药过敏的病人，治疗不常见的菌种(如氯霉素治疗沙门菌或某些假单胞菌)等方面应用。
3．药敏纸片保存在干燥环境，8℃以下冷藏或-20℃冷冻保存。β内酰胺类药敏纸片应密封冷冻保存，仅取出少量作为日常使用，在冰箱保存约一周。有些不稳定的抗生素(如头孢克拉、棒酸合剂)须冷冻保存，用时取出。纸片在使用前1～2小时从冰箱取出，暖至室温再打开，以避免出现冷凝水。纸片启封后应放人可密封的有干燥剂的容器中，在有效期内使用，过期应废弃。
4．M—H琼脂(Mueller—Hintonagar)培养基制备成分：酪蛋白水解物17．59琼脂17．09牛肉浸膏2．09淀粉1．59H201000mlpH7．3±0．125℃制备：将上述成分加到1000ml双蒸水中，混合，加热煮沸，校正pH7．34-0．1，高压灭菌15psi(121℃)15分钟，取出后立即放40～50。C水浴。在无菌操作室内，水平台上倾倒平皿，琼脂厚度4mm，内径14cm平皿需培养基60～70ml，内径9cm平皿需25～30ml。待平板冷至室温，置2～8℃冰箱保存，须在1周内用完。注意：①每批制备的平板应抽样放30～35℃24小时以上，检查是否无菌，抽样平板不可再用；②使用时，平板从冰箱取出，预热至室温，琼脂表面应潮湿，但不应有水珠，培养时，平皿盖上亦不应有水珠。
5．接种菌液制备①增菌法：选择琼脂平板上形态相同的菌落至少4～5个，用接种环挑其顶部，移种到4～5ml肉汤或大豆酪蛋白消化液中，35℃培养2～6小时，菌液浓度达到或超过0.5单位麦氏比浊管浓度，用生理盐水或肉汤校正菌液浓度至与麦氏单位标准比浊管相同[约(1～2)×108CFU／m1]。②细菌直接悬液法：可直接用过夜培养的菌落在盐水或肉汤中制备接种菌液，浓度调至0.5麦氏单位标准比浊管。
6．接种平板M．H琼脂平板用前烘干，用一无菌棉拭子蘸取菌液，并在试管上端管壁旋转挤压几次，去掉过多菌液，用拭子涂布整个琼脂平板表面，反复涂布几次，每次将平皿旋转60°，保证涂布均匀。接种后加盖，晾干几分钟后贴加药敏纸片，注意校正菌液须在15分钟内使用。
7．贴纸片接种平板后，贴药敏纸片，用镊子或针尖压一下纸片使其与培养基表面贴牢。纸片要贴均匀，纸片与纸片中心距离不得<24mm。原则上，直径140mm平板贴12张纸片，直径90mm平板贴6张纸片。贴上纸片15分钟内，需把平板倒放，置在35℃孵箱中。
8．培养在35℃孵箱经16～18小时培养后，观测结果。注意：不能在CO：环境中培养，叠放平皿不要超过两个。
9．测量抑菌环孵育后，手持平皿，从背面目测检查每块平板，用卡尺测量每个抑制环直径(包含纸片的直径)，并以mm为单位记录大小。
10．结果判断参照表6-3—1标准，根据抑菌环大小作出判断，分敏感、中介和耐药三级报告结果。
11．质量控制所有敏感性试验对于培养基，接种物、孵育温度、时间等变动都很敏感。为了进行准确、可靠的试验，每次试验均设大肠埃希菌(ATCC-25922)作为质控菌株，质控符合要求，才能发报告。
(二)琼脂稀释法琼脂稀释法药敏试验是将抗菌药物稀释成不同浓度，然后与融化并冷至50～55℃的琼脂培养基混合均匀，倾注平板，再接种试验菌，经培养后，观察细菌生长情况，能抑制细菌生长的最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度(MIC)。
[*]抗菌药物原液配制与稀释阿莫西林、替卡西林、头孢噻吩等大多数抗生素用0.1mmolfLpH6．0PBS(磷酸盐缓冲液)溶解和稀释；胺曲南用饱和碳酸氢钠溶解后水稀释；氟喹诺酮(环丙沙星除外)用1／2容量的水，滴加0.1mmoL／LNaOH至完全溶解水稀释；阿奇霉素、氯霉素用95％乙醇溶解水稀释，头孢替坦用二甲亚砜溶解水稀释。总之，要按标准要求溶解和稀释各种抗生素。
[*]培养基制备M．H琼脂配制时加水量要减少1／10，以备添加稀释好的抗生素溶液。琼脂培养基经121℃灭菌15分钟，于水浴中冷却至45～50℃；在每个直径9cm平皿中，加M—H培养基25ml，稀释好抗生素溶液2.5ml，充分混合，制备含有抗生素的琼脂平板，密封在塑料袋，4～8℃冰箱保存，可使用一周。
[*]接种方法将试验菌稀释成107CFU／ml细菌浓度，取一环(约2μg)接种到含有一系列抗生素的琼脂平板上。接种前平板必须相当干燥，从低浓度琼脂平板开始，在30分钟内完成接种，每次试验需点种一个不含抗生素M—H平板以及质控菌株(ATCC．25922)作质控对照。
[*]培养接种好的平板，放置室温让接种液被充分吸干后，置(35±2)℃孵箱内16～20小时，读取结果。
读取结果和报告首先读取质控菌株MIC，然后读试验菌株测定的MIC值，MIC单位为¨/ml，根据MIC值，报告相应的敏感或耐药结果，或同时将MIC值附在敏感或耐药后面。
对于做药敏试验的老师们很有指导意义。 谢谢楼主分享，多多学习，Thanks♪(･ω･)ﾉ 路过学习，谢谢分享给大家，医院发布时间48小时。 谢谢老师分享！ 对于微生物实验室老师做药敏试有指导意义，值得学习和借鉴。 lyluoxiuhua 发表于 2018-11-29 09:12
对于微生物实验室老师做药敏试有指导意义，值得学习和借鉴。
{:1_17:}{:1_17:}{:1_17:} 芳芳123 发表于 2018-11-29 09:11
谢谢老师分享！
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一起学习一下。 川页 发表于 2018-11-29 08:59
谢谢楼主分享，多多学习，Thanks♪(･ω･)ﾉ
我们感控人是最爱学习的人！{:1_14:} toto 发表于 2018-11-29 08:33
对于做药敏试验的老师们很有指导意义。
同意。。。
{:1_17:}{:1_17:}{:1_17:} lyluoxiuhua 发表于 2018-11-29 09:12
对于微生物实验室老师做药敏试有指导意义，值得学习和借鉴。
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和老师们一起了解一下。。。
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