酶类消毒剂卫生要求
征求意见丨国家标准《酶类消毒剂卫生要求》2018-01-24 感控新青年来源丨感控新青年作者丨卫生标准网视觉丨那颜中华人民共和国国家标准酶类消毒剂 第1部分：溶葡萄球菌酶和溶菌酶消毒剂Hygienic requirements for enzyme Part 1: lysostaphin and lysozyme disinfectants目次前言11 范围22 规范性引用文件23 术语和定义24 原料要求35 技术要求36 应用范围47 使用方法48 运输、贮存和包装59 标志要求510 检验方法5附录A（规范性附录）溶葡萄球菌酶酶活性测定7附录B（规范性附录）溶菌酶酶活性测定9附录C（资料性附录）溶葡萄球菌酶色源底物制备11前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会提出并归口。本标准由上海市疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、复旦大学起草。本标准主要起草人：田靓、朱仁义、袁政安、沈伟、沈瑾、邱侠、陆婉英、黄青山、李国栋、陆晔、赵晓蔚、黄晋江、吴宏宇。酶类消毒剂 第1部分：溶葡萄球菌酶和溶菌酶消毒剂1范围本标准规定了溶葡萄球菌酶和溶菌酶类消毒剂的原料要求、技术要求、应用范围、使用方法、检验方法、标志和包装、运输和贮存、标签和说明书及注意事项。本标准适用于以溶葡萄球菌酶和（或）溶菌酶为主要杀菌成分的酶类消毒剂。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 191 包装储存图示标志GB 27950 手消毒剂卫生要求GB 27951 皮肤消毒剂卫生要求GB 27954 黏膜消毒剂卫生要求GBXXXX 消毒产品标签说明书通用要求化学药品地标升国标第九册 原卫生部消毒技术规范 原卫生部中华人民共和国药典（二部） 国家食品药品监督管理总局 2015年版消毒产品生产企业卫生规范 卫法监发〔2000〕217号3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 酶类消毒剂 enzyme disinfectant以酶为主要杀菌成分的消毒剂。3.2溶葡萄球菌酶 lysostaphin能水解细菌细胞壁肽聚糖中的甘氨酸肽键，使细菌死亡的酶。3.3溶菌酶 lysozyme胞壁质酶、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，能水解细菌中黏多糖的酶。3.4酶活性单位 enzyme activity unit酶活性的度量单位。1个酶活性单位指在特定条件下，在单位时间内转化单位底物（或转化底物中单位有关基团）的酶量。4原料要求4.1溶葡萄球菌酶白色或微黄色粉末，无臭、易溶于水；按干燥品计算，酶活性单位应≥100U/mg。4.2溶菌酶应符合《化学药品地标升国标第九册》中溶菌酶的要求。4.3生产用水应符合《中华人民共和国药典（二部）》中纯化水的要求。4.4其他原料应为食品级或化学纯或符合药典规定的原料，不得使用工业级，并符合国家有关规定。4.5禁用物质不应含有抗生素、抗真菌药物、激素以及国家规定的其他禁用物质。5技术要求5.1外观不分层、无沉淀和悬浮物、无异味。5.2理化指标5.2.1pH值pH值应为5.0～8.0。5.2.2有效含量消毒剂中溶葡萄球菌酶的活性范围为0.5U/mL～20U/mL，溶菌酶的活性范围为10000U/mL～200000U/mL。5.2.3稳定性产品有效期应≥12个月。5.2.4上下限值产品有效成分含量在标示量80%～150%之内。5.3杀灭微生物指标作用浓度和时间按产品标签说明书的要求，杀灭微生物指标应符合表1要求。杀灭微生物指标
项目杀灭对数值
悬液法载体法
大肠杆菌（8099）≥5.00≥3.00
金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）≥5.00≥3.00
铜绿假单胞菌（ATCC 15442）≥5.00≥3.00
白色念珠菌（ATCC 10231）≥4.00≥3.00
自然菌（现场试验a）≥1.00
a用于手消毒做手现场试验，用于皮肤或黏膜消毒做皮肤现场试验。
用于手消毒应符合GB 27950的要求；用于皮肤消毒应符合GB 27951的要求；用于黏膜消毒应符合GB 27954的要求。6应用范围适用于手、皮肤和黏膜的消毒。按厂家说明书并有实验依据的可依据相关要求，增加其他应用范围。7使用方法7.1手消毒卫生手消毒取适量消毒剂于手心，双手互搓使均匀涂布每个部位，作用时间应符合GB 27950的要求。外科手消毒外科洗手后，取适量消毒剂均匀涂布于双手、前臂和上臂下1/3的皮肤，作用时间应符合GB 27950的要求。7.2皮肤消毒7.2.1完整皮肤取消毒剂原液，或将消毒剂原液用符合《中华人民共和国药典（二部）》的纯化水或无菌水稀释至说明书规定浓度，均匀喷雾或用医用棉拭子擦拭皮肤表面，作用时间应符合GB 27951的要求。7.2.2破损皮肤从原包装倒出后一次性使用。取消毒剂原液，或将消毒剂原液用符合《中华人民共和国药典》的纯化水或无菌水稀释至说明书规定浓度，冲洗破损皮肤表面，作用时间应符合GB 27951的要求；或用消毒剂浸透无菌纱布后敷贴于破损皮肤表面。7.3黏膜消毒7.3.1口腔黏膜从原包装倒出后一次性使用。用消毒剂原液，或将消毒剂原液用符合《中华人民共和国药典》的纯化水或无菌水稀释至说明书规定浓度，均匀喷雾或用医用棉拭子擦拭或含漱，作用时间按照说明书，最长作用时间5min。7.3.2阴道和外生殖器黏膜从原包装倒出后一次性使用。用消毒剂原液，或将消毒剂原液用符合《中华人民共和国药典（二部）》的纯化水或无菌水稀释至说明书规定浓度，用医用棉拭子擦拭或灌洗或冲洗，作用时间按照说明书，最长作用时间5min。8运输、贮存和包装8.1运输运输产品时应避免日晒、雨淋。不得与有异味或影响产品质量的物品混装运输。8.2贮存室温阴凉处保存，避光、密闭、干燥，不得与有异味或影响产品质量的物品同处贮存。8.3包装产品的包装应无毒和清洁，包装材质应符合相应材料的化妆品包装要求。产品的包装应密封，能保证产品的稳定性以及在储存运输、使用过程中的安全性。9标志要求 9.1包装标示应符合GB/T 191的要求。9.2标签和说明书应符合《GB消毒产品标签说明书管理规范》的要求。9.3注意事项9.3.1外用消毒剂，不得口服。9.3.2避免接触拮抗物。不能与阴离子表面活性剂、Ba2+、Ca2+、Mg2+等同时使用。9.3.3置于儿童不易触及处。9.3.4对蛋白质过敏者慎用。10检验方法10.1检验规则依据《消毒产品生产企业卫生规范》出厂检验应当对产品理化指标进行检测。10.2外观用肉眼观察其色泽、形态，用嗅觉鉴别其气味。10.3pH检验按《消毒技术规范》规定方法测定。10.4有效含量检验10.4.溶葡萄球菌酶活性测定按照附录A规定方法测定。10.4.2溶菌酶活性测定按照附录B规定方法测定。10.5稳定性试验按《消毒技术规范》的方法，用微生物法进行稳定性实验。有效期<24个月，用自然留样法测定；有效期为24个月，根据产品性能，选用37℃存放90d的方法，或用自然留样法测定。在有效期内，有效成分含量不得低于标示量的下限值。10.6杀灭微生物检验按《消毒技术规范》有关规定测定。宜采用悬液法；若选用载体法时，应采用非吸附性材料（金属、玻璃、猪皮等）做载体。（规范性附录）
溶葡萄球菌酶酶活性测定1.1原理以偶联活性艳蓝染料KNR的金黄色葡萄球菌细胞壁肽聚糖（KNR-PG）为色源底物，根据酶作用过程中定量地释放带有KNR染料基团的小分子可溶性片段产物，在除去未反应的不溶性底物后，对上清液进行比色测定溶葡萄球菌酶酶活性。在pH10.0的1.2mL反应体系下，37℃温度下，在波长595nm处，每min使KNR-PG溶液吸光度值增加0.35的酶量为1个溶葡萄球菌酶酶活性单位。1.2仪器与试剂仪器1.2.1.1紫外-可见分光光度计或酶标仪。1.2.1.2高速冷冻台式离心机。1.2.1.3电子天平。1.2.1.4电热恒温水浴锅。1.2.1.510μL、20μL、200μL、1000μL移液枪及配套枪头。1.2.1.6旋涡混合仪。1.2.1.7定时器或秒表。试剂1.2.1.8溶葡萄球菌酶标准品溶液（Lysn）：按照溶葡萄球菌酶活性单位定义，对溶葡萄球菌酶冻干粉进行标定。需要时，用Tris-HCl缓冲液溶解，配制成0.9U/mL的标准品溶液，-20℃贮存，每次试验用1支，避免反复冻融。1.2.1.9甘氨酸、氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、95%乙醇均为分析纯。1.2.1.10Gly-NaOH缓冲液：甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，0.2mol/L，pH10.0。1.2.1.11Tris-HCl缓冲液：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，0.05mol/L，pH7.5。1.2.1.12色源底物KNR-PG溶液：按照附录C方法制备色源底物KNR-PG，用Gly-NaOH缓冲液以1:5（m/v）比例均匀悬浮。1.3试验步骤标准曲线的制备取洁净干燥的Eppendorf管6只，标号，按表A.1顺序每管中加入对应量的溶葡萄球菌酶标准品溶液（A.2.2.1），再加入不同量的0.2mol/L Gly-NaOH缓冲液（A.2.2.3）。然后按序号加入色源底物KNR-PG溶液（A.2.2.5）130ul，每管加入底物后迅速在旋涡混合仪上混匀。将加好上述溶液的Eppendorf管迅速移入37℃的恒温水浴锅中定时反应20min。从水浴中取出Eppendorf管，按序号加入300μL 95%乙醇终止反应，并于10000rpm离心10min，离心结束后，取上清液于595nm处，以0号管为空白测定吸光度。根据测得的吸光度值及相对应的标准品溶葡萄球菌酶酶活性（U/mL），求得线性回归曲线： C0=（A-B）/K………………（A.1）式中：C0——标准品溶葡萄球菌酶酶活性（U/mL）；A——吸光度；B——截距；K——标准曲线的斜率。标准曲线制备
管号012345
底物/μL130130130130130130
Gly-NaOH缓冲液/μL770750730710690670
Lysn/μL020406080100
37℃恒温水浴定时反应20min
95%乙醇/μL300300300300300300
Lysn终浓度/U/mL00.020.040.060.080.1
样品的测定待测样品的测定方法同标准曲线，取50μL用于测定。平行测定3次，计算平均值。1.4结果计算根据标准曲线，计算未知溶液中溶葡萄球菌酶酶活性，见式（A.2） C = C0×V反/V样×N …………………（A.2）式中：C——样品溶葡萄球菌酶酶活性（U/mL）；C0——标准品溶葡萄球菌酶酶活性（U/mL）；V反——反应体系体积，为0.9mL；V样——样品加入体积，为0.05mL；N——样品稀释倍数。（规范性附录）溶菌酶酶活性测定1.5原理溶菌酶通过溶解G+菌细胞壁使细菌溶解，菌液在可见光范围内的吸光度降低，以溶壁微球菌为底物，用分光光度法，以450nm波长处菌液单位时间内吸光度降低程度测定溶菌酶酶活性。在室温25℃、pH为6.2时，在波长450nm处，每min引起吸收度下降0.001为1个溶菌酶酶活性单位。1.6仪器与试剂仪器1.6.1.1紫外-可见分光光度计或酶标仪。1.6.1.2电子天平。1.6.1.3电热恒温水浴锅。1.6.1.410μL、20μL、200μL、1000μL移液枪。1.6.1.5定时器或秒表。试剂与材料1.6.1.6磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钠10.4g与磷酸氢二钠7.86g及乙二胺四乙酸二钠0.37g，加水溶解使成1000mL，调节pH至6.2。1.6.1.7溶壁微球菌。1.7试验步骤样品溶液制备精密量取样品，用磷酸盐缓冲液稀释成约1000U/mL的溶液，稀释所用倍数记为N。底物悬浮液的制备 临用前配制。称取溶壁微球菌15 mg～20 mg，加磷酸盐缓冲液0.5mL～1mL,在研钵内研磨3min，再加磷酸盐缓冲液适量，使总体积约为50mL，悬浮液于25±0.1℃在450nm波长处测得的吸收度为0.70±0.05。样品测定精密量取25±0.1℃的底物悬浮液3mL，置比色池中，在450nm的波长处测定吸收度，作为0s的读数A0，然后精密量取25±0.1℃的供试品溶液0.15 mL（相当于溶菌酶7.5μg），加到上述比色池中，迅速混匀，用秒表计时，至60s时再测定吸收度A；同时精密量取磷酸盐缓冲液0.15 mL，同法操作，做为空白试验，测得0s的读数A'0及60s的读数A'。平行测定3次，计算平均值。1.8结果计算根据标准曲线，计算未知溶液中溶菌酶酶活性，见式（B.1） C＝式中：C——样品溶菌酶酶活性（U/mL）；A0 ——样品0s时的吸收度；A ——样品60s时的吸收度；A'0——空白0s时的吸收度；A' ——空白60s时的吸收度；N ——稀释倍数。（资料性附录）溶葡萄球菌酶色源底物制备1.9试剂金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌（RN4880 复旦大学），作为底物菌用于制备溶葡萄球菌酶底物。三氯乙酸（TCA）10% TCA：取三氯乙酸10 g，溶解于100 mL纯水中。5% TCA：取三氯乙酸5 g，溶解于100 mL纯水中。0.05 mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris-HCl）取三羟甲基氨基甲烷6.0 g，加水800 mL溶解，用盐酸调节pH至7.5后，用水稀释至1000 mL。0.25 N 氢氧化钠溶液取氢氧化钠10.0 g，加水1000 mL溶解。其他试剂生理盐水、胰蛋白酶、艳蓝染料（KNR染料）、叠氮钠、纯水。1.10方法按照《消毒技术规范》有关规定制备金黄色葡萄球菌悬液。对菌悬液121℃ 20 min灭菌后进行离心，收集菌体。菌体沉淀用生理盐水离心洗涤2次。用7倍菌体重量的10% TCA溶液悬浮菌体，4℃放置72 h。离心，将菌体用生理盐水离心洗涤一次。用5倍菌体重量的5% TCA溶液悬浮菌体，90 ℃水浴10 min。离心收集沉淀，生理盐水离心洗涤3次。用5倍菌体重量的Tris-HCl悬浮菌体，按0.5 mg/mL浓度加入胰蛋白酶，置于37 ℃水浴24 h。菌体于90 ℃水浴10min，灭活胰蛋白酶。离心收集沉淀，用纯水离心洗涤3次。用少量纯水悬浮菌体，于4 ℃下对纯水透析24 h。离心，收集沉淀。按7倍菌体重量，配制0.25N的氢氧化钠溶液适量。用配制好的0.25N的氢氧化钠溶液的一半体积悬浮菌体。按1/7的菌体重量称取KNR染料，用剩余的氢氧化钠溶液进行溶解。在悬浮的菌液中加入配制好的染料，37℃水浴24 h。离心，纯水洗涤至上清液无色，用少量纯水悬浮菌体，转移至保存容器内，按10 mg/L浓度加入叠氮钠，4℃保存。
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