汤一苇教授讲座及答疑：微生物基因诊断在临床微生物学中的地位和应用
转自丁香园,谢谢原作者!汤教授回答了网友的问题,其中有我(yuangan)的一问(问题6),谢谢汤教授指导,请本论坛会员参考!http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=146&id=13063728&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#13063728
汤一苇，美籍华人临床和基因微生物诊断学家。一九八二底年获上海复旦大学医学院医学学士学位，一九八五年获上海复旦大学研究生院流行病学硕士学位，一九九五年获美国范德堡大学研究生院微生物学与免疫学博士学位。曾先后在美国联邦疾病控制预防中心、范德堡大学医学院和美国梅约医学中心接受博士后或住院医师培训。是美国医学微生物委员会资格认证并持有田纳西州执照的临床微生物学家。现任美国范德堡大学内科系和病理系双系副教授，病理系传染病分子生物学诊断室和内科系分子流行病室主任。
二零零二年入选为美国微生物学会核心期刊<<临床微生物学杂志>>主编之一，二零零五年入选为美国微生物学院院士和美国传染病学会会士，二零零八年入选为复旦大学闻玉梅院士主编<<微生物与感染>>杂志副主编。
在传染病流行病学、临床微生物学、免疫学、和分子生物学等领域中积累了丰富经验。主要科研成果包括证实汉坦病毒存在血凝素并建立血凝抑制技术；首次从非啮齿类动物体内分离出汉坦病毒并提供家猫传播出血热的流行病学依据；证实辅助淋巴细胞免疫失调为呼吸道合胞病毒疫苗增强疾病之原因；发现泡疹病毒感染和原发性肺纤维化致病机理有关以及首先发现并命名导致新生儿败血症医院内流行的不动杆菌新株。作为在美国临床开展感染性疾病基因诊断第一梯队的主要成员，建立了体外核酸扩增诊断技术并用于传染病病原体的检测和定量。在最近的数年里，开发研制了四十余种新型分子微生物学诊断技术、拥有美国或中国专利局专利四份并发表相关论著、综述和著书章节近两百篇。
问题一：
战友fsyqx：目前有没有真菌基因分型的有关检验方法？例如浅部真菌中的丝状真菌，除了形态学方面的诊断外，有没有更客观一点的指标？
战友zhaoxm777：我是一名危重病专业的医生。我们知道由于ICU患者的特殊性，使其成为侵袭性真菌感染的高发人群，且正成为导致ICU病人死亡的重要原因之一。针对真菌的检测主要依靠形态学和免疫学等检查，如GM或G试验，但是对于相应检测真菌是否具有侵袭性或是侵袭强度却很难评定；我想请教目前针对这方面，微生物基因诊断有新的进展或者相关发展思路吗？
战友zwq_096：目前深部真菌感染发病率及死亡率正逐年上升，尤其是在免疫缺陷患者。但常规传统的培养及活检方法不能早期得到诊断，这样就延误了该类疾病的治疗，也就造成了高的死亡率。目前新型的诊断方法主要为血清学检测抗原抗体，分子生物学检测基因方法，但这些方法的实施仍存在很大的问题，如PCR方法：标本类型的多样性；标本处理方法的不一致性；扩增针对靶点的不同， PCR反应类型的多样性；及结果评价的不一致性。。。。等等。
所以造成这类方法的未被临床所推广应用，那么是否可以有这样一些组织,可以对该类方法进行一个一致性的评估,进而能将该类方法推广到临床,以能缓解该类深部真菌感染的诊断及改善预后呢?
谢谢.
汤教授的答案：
这三个问题涉及真菌实验室诊断，我试着将其合并回答。
真菌感染诊断确实棘手，它有技术和临床两方面的原因：
1、技术本身：显微镜直接检查，抗原以及抗体检测灵敏度及特异性均不高，作为金标准的真菌培养费时且一些无菌标本（血、脑脊液等）中深部真菌培养灵敏度相当低。
2、临床联系：由于绝大多数真菌为条件性致病菌并广泛存在于环境及人体皮肤粘膜表面，非无菌标本中一般定性检查难以区别环境污染，“正常菌群”或感染。
目前趋势除了大力寻找高亲和性高特异性抗体用于真菌抗原快速检查外，采用定量PCR方法检测半无菌体液标本中特异性真菌载量可能有希望。另外现有人应用细胞因子等宿主反应以确定所检测到的真菌是否有临床意义。上海中山医院呼吸科白春学主任和我业已开始这方面的合作，希望在一两年之内有些结果。
问题二：
战友nb1995703问：细菌存在保守区域，可以利用之进行公共引物的设计；请问病毒是否也存在这样的区域？不同的病毒（有的是RNA病毒，有的是DNA病毒）能否设计通用引物？谢谢！
汤教授的答案：
病毒不存在共同的保守基因区，但可以从下列方面试着进行“新”病毒的检测和寻找。
1、针对某一科(family)病毒的相对保守区（如DNA或RNA多聚酶基因）采用兼并(degenerate)引物放大全部可能的该科病毒，然后序列分析PCR产物。
2、采用差异显示技术(differential display technique)。
3、采用芯片技术对大批已知病毒进行检测鉴定。
4、采用随机PCR放大方法，在应用这种方法时，“未知”病毒的含量一定要大，所以一般用于病毒培养产物的鉴定。
问题三：
战友breezeface问：目前临床用于鉴定的方法还是生化鉴定为主，如果微生物基因诊断应用于临床，相对于生化鉴定来说，有什么优势和劣势呢？
汤教授的答案：
基因诊断用于微生物鉴定的主要优势是快速、客观。其缺点是除了价格较贵外，结果解释（比如99.2%核苷酸序列同源性的临床意义）上还有些问题。
问题四：
战友gong329问：9月份的感染病年会分会场您的讲座收益非浅，当时没来得及向您请教，对于病毒的基因诊断方面很感兴趣，请问：在实验室自己建立病毒基因诊断方法时，一般阳性标本，以及标准品我们应该选用什么呢？特别是一些尚未建立良好体外培养模型的病毒（RNA病毒，DNA病毒），我们应该如何设立阳性标本和标准品呢？谢谢汤教授！
汤教授的答案：
谢谢你抽时间参加我的讲座，可能是杭州景色太美气候太好的缘故，能坚持在会场的人数不多http://img.dxy.cn/images/smiles/smile.gif。
最好的阳性对照是合并（pooled）的多个临床检测阳性标本。此外，对于DNA靶基因，可以将PCR片段克隆到质粒中，将质粒掺入合并的临床检测阳性标本中。另外，对于RNA靶基因，大量的特异RNA片段可以采用体外翻译的RNA或披甲（armored）RNA方法获得。
问题五：
战友zfx007：我对于微生物基因诊断在临床在临床微生物中的应用很感兴趣，请问：在乙型肝炎治疗过程中，主要的药物是核苷酸类似物，但耐药率发生率高，严重影响医生对远期疗效的信心，也大大增加了患者的医疗费用，所以对耐药基因的检测已经有了很大的呼声，但HBV P基因YMDD变异的检测技术要么费用高、检测繁琐，无法普及，要么只能检测一种优势株，对于混合型感染通常不能识别，而且检测结果各地差异极大，没有相对稳定的一种检测方法，请问汤一苇教授，目前有没有既敏感、特异、快捷又可以推广的HBV P基因YMDD变异的检测技术？
战友CZj99：我对于微生物基因诊断很感兴趣，微生物基因诊断,在快速,准确等方面有自已独特的优势.请问：微生物基因诊断与临床的治疗如何有效的结合,如HBV可用拷贝数判断疗效,细菌的变异,但如何将微生物基因诊断象药敏试验结果指导临床治疗?谢谢！
战友yangjielaila：本人对幽门螺杆菌基因诊断方面很感兴趣，当前尽管诊断幽门螺杆菌现症感染方法很多，也非常成熟并应用您临床。但是目前，因为幽门螺杆菌耐药性增加，因为培养的延迟性，体外耐药性可能和体内的真是耐药情况不一样等问题，临床上，都是按照所谓一线、二线补救治疗的”且战且走“。
请问：能否通过基因诊断的办法快速、且预先知道患者所感染的幽门螺杆菌对现用的抗生素耐药情况，如阿莫西林，克拉霉素等。谢谢汤教授！
汤教授的答案：
这三个问题均涉及应用基因方法检测病原体耐药。目前已有较好的基因方法检测耐药有关的突变点/基因，如等位基因特异性(allele-specific)PCR及测序。测序分析对混合感染的多重突变点检测灵敏度较低，这时可以采用经典的克隆测序。
但是采用基因分析方法测定耐药的致病问题为：1、许多药物耐药机理不清。2、病原体在不断变异中。
问题六：
战友yuangan：我对于微生物基因诊断在临床在临床微生物中的应用很感兴趣，请问国外临床微生物在医院感染预防控制发挥怎样作用？谢谢！
汤教授的答案：
临床/基因微生物方法至少可在两方面在医院感染预防控制中发生作用。
1、早期快速确定医院感染病原体，帮助及早隔离病人。
2、明确病原体分型，提供病原体间相互联系的分型信息，协助临床发现传染源及传播途径。
问题七：
战友gj2003：我对于细菌诊断及基因分型很感兴趣，请问：用定量PCR做细菌定量检测时如何测定出细菌基因组DNA中的某个特定的保守基因的拷贝数？因为只有这样，才能通过定量这个基因对细菌的个数进行定量(如果我这样理解准确的话)。
汤教授的答案：
你首先要有一个已知数量的该菌对照。这可以是已知菌落形成单位(colony-forming unit)的真正细菌，也可以是已知拷贝数的克隆入该片段的质粒。然后你用不同稀释度的已知对照建立标准曲线。
值得你注意的是，不少基因在不同细菌株中基因数不同。建议采用单基因数或恒定基因数的基因作为定量分析。
问题八：
战友CDMA133：我对于细菌诊断在临床中的应用很感兴趣。请问：正常人体内是存在很多种类细菌的 ，如何通过技术的手段区分那些细菌是致病菌？或是说如何鉴定那些原本不致病的细菌已经变为致病菌呢？同一种细菌，其是致病状态还是不致病状态如何鉴别？谢谢！
战友plasmid15：我对于微生物基因诊断很感兴趣，请问：在病原菌的基因检测中，活菌和死菌都能被检测出来，而在实际生活中，能检测到活菌对我们来讲更有意义，现在有什么方法能检测出活菌吗？
汤教授的答案：
这两个问题涉及到基因检测结果的解释。一个阳性PCR结果可以是正常菌落，污染、定殖(colonization)或感染。可以是隐性感染，也可以是感染业已受到控制的“死”菌。总的来说，如何判定需要结合临床及样本类型进行综合分析。当然，可以检测一些致病特异性基因（如金葡菌的PVL基因）对致病性进行评价。治疗以后，可以检测病原体的信使RNA进行疗效考核。
问题九：
战友hxf0511：我对于微生物基因诊断很感兴趣.我来自呼吸科。近些年来，随着新的传染病的出现，如非典型肺炎（SARS），禽流感等，以及肺炎的患病率、住院率的逐年升高，肺部感染备受关注。我的问题：
1， 对于住在ICU的病人，其体质差，基础病多，很易感染。早期合理治疗尤为重要， 然而我们传统的微生物培养、生物化学、免疫学等检查，因时间长和敏感性不一的缺陷，常常耽误治疗。微生物基因诊断有何优势？
2，由于抗生素还存在不合理应有的现象，这种由抗生素滥用导致的微生物基因变化，是否会影响到微生物基因诊断？
3，目前微生物基因诊断应用于临床还有哪些瓶颈？谢谢！
汤教授的答案：
如你所说，微生物基因诊断可以较早较灵敏地发现病原体。特别是那些业已应用广谱抗生素的病人。抗生素滥用导致的微生物耐药为我们做临床微生物检测提供了工作保证http://img.dxy.cn/images/smiles/smile.gif，也将促进该行业的发展。试想将来由于多重耐药菌株的产生，临床将无广谱抗生素可作为经验(empiric)治疗的话，临床医生将会应用快速耐药检测的基因方法所得到的结果指导治疗。
瓶颈还有很多，但主要是基因检测结果的分析判定。我们需要你这样的临床医生一起帮助。
问题十：
战友jjgbmt：微生物分子生物学分类对诊断和治疗有意义？我是搞致病念珠菌分类的，很多人说这种分类意义不大，您怎么看？
汤教授的答案：
我认为念珠菌的早期快速分型在临床上有一定的意义。不同的念珠菌种的潜在耐药性不同，而常规的念珠菌耐药性检测费时耗钱。所以早期将念珠菌鉴定到种(species)的水平对指导用药会有帮助。
战友DHZX：我对于肠道致病菌的基因诊断很感兴趣，目前微生物的基因诊断在临床应用很少，一是特异性的问题，二是快速诊断如基因芯片成本太高等原因！请问：有没有切实可行且应用性较高的基因诊断方法应用于临床实验室对肠道致病菌的快速诊断？
我完全同意你的分析，在美国的临床微生物实验室中，肠道致病菌的检查是最最“少、慢、差、贵”的。最近一两年来，有人采用新型质谱(MALDI-TOF)方法对可疑菌落进行快速鉴定，也可望将肠道致病菌的确诊从常规的三天减少到一天左右。
问题十一：
战友yanjie：我们都知道，致病微生物的基因检测在感染性疾病的诊断中有重要作用。由于方法学的进展非常迅速，许多新型技术尚未得到管理部门(在中国为SFDA)的批准而无法用于临床检测。比如目前我们已经可以用PCR产物直接测序的方法监测HBV核苷类似物耐药变异，但无法用于常规临床工作。请介绍一下在美国新型检测技术在得到FDA批准前如何应用于临床。
汤教授的答案：
这点上美国的FDA要比中国SFDA“开通”一些。在美国一些具有科研实力且临床要求的一流医学中心通常有自发研制的基因诊断产品，经该中心/医院认真考核并批准后在该中心/医院内部使用于临床并向病人收费。当然这一切都是在CAP认证的临床试验室中进行，同时需要经过能力验证(proficiency test)。
问题十二：
战友ziman2003：我对于您研究的领域很感兴趣。我的专业是植物病毒的快速检测。请问您，现在 有没有一种很好病毒的快速检测方法。目前，我查阅的常用的就是根据病毒的通用引物扩增病毒DNA。可是这样做很费时间和人力，如果检测的对象很多就不是很方便，而且假阳性也很多。也有人用杂交或者酶联免疫的方法，这个也比较的费时间。我在想，能不能把植物的叶片或者组织直接取下，特殊的溶液中研磨离心 ，直接荧光定量PCR呢？从叶片到PCR都是一管的。您说行得通吗？或者您有什么好的idea吗？非常谢谢！！
战友carolynzy：我想请教关于临床标本预处理方面的问题。临床标本多种多样，虽然每一类有基本的预处理原则，但即使是同一类标本的个体差异也很大（如血液标本的血脂含量，溶血等），经过同样的处理，结果也可能差异很大。有些因素可能对检测造成不良影响。请问针对血液、痰、胸水、脑脊液、腹水、尿这些标本，哪些因素是必须控制好，某些差异可以容忍的呢？
汤教授的答案：
这两个问题涉及标本处理核酸提取。一个好的提取方法可以裂解细胞，稳定核酸，去除抑制物并浓缩核酸。我想任何一种方法只要能够克服抑制物并提高核酸回收量（没有假阴性）均有应用空间。对于定性分析来讲，标本的种类要求不大。对于定量分析，你可能在上述因素的基础上，可以在标本的处理之前，加入已知数量的“内对照”基因，这样你可能对核酸的回收量进行质控并调节。
问题十三：
战友juchy3572：我对于微生物检验的发展前景很感兴趣，请问：在未来，微生物基因诊断技术是否会成为微生物检验的主要手段？常规微生物培养、血清学诊断技术是否会逐渐没落，越来越少人用？
汤教授的答案：
微生物基因诊断技术业已成为临床微生物实验室中的一个重要手段。但我觉得其他方法不会没落消失。特别是细菌学方面。我们仍需要分离到病原做常规的药敏试验。如前所述，不是所有病菌耐药机制都已知晓，同时病原体在不断的变异之中。
丁香园通讯员 edited on 2008-11-21 14:3 谢谢分享！:handshake 谢谢分享，受益非浅。:D :D 看了相关内容,对我很有收获,谢谢 丁香园通讯员：汤教授您好，此次会议丁香园的很多网友都不能来到现场，能否请您给我们简要介绍一下您此次会议报告的大体内容？
汤一苇教授：这次主要报告了三个内容，希望给临床医生提供基因诊断方面的方法，并告知如何用用。首先是中枢神经系统感染的诊断，因为以前中枢神经系统疾病的诊断都是靠临床医生的经验，现在我们可以用比较先进的方法，比较特异性的技术来进行诊断。其次，我给大家介绍了“甲氧西林对金黄色葡萄球菌监测”的最新进展，大家都知道，这是一个很重要的医源性的感染，我们国家现在还没有开始，国外正在争论要不要做普查，怎样去做等，在这里我把一些方法告诉大家。最后，我讲了结核耐药性的检查方法，是一种分子生物学的方法。
丁香园通讯员：听说汤教授也知道我们丁香园，能谈谈您对丁香园的看法么？
汤一苇教授：我是去年在上海参加肺科会议时了解到丁香园的，当时看到你们在会场上很活跃。我觉得丁香园网站的形式很好，但是距离建立一个很好的品牌，还有很长的一段路要走，希望你们成功！
丁香园通讯员：谢谢汤教授！ 长知识了！谢谢分享！虽然不能完全理解，但难得看到这么专业的讲座，受益非浅．:handshake :handshake :handshake 收获很大,受益非浅,谢谢! 微生物基因诊断，前景是美好的，道路是曲折的。 汤一苇教授，将被邀请在2010年6月的南京会议上做专题报告。
微生物基因诊断，是全球的趋势。
本帖虽然有点难，但是我们感控人，应该认真地读一读，这样我们的知识才不会太落伍！ 拜读了，我觉得星火版主的问题很好！
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